大鼠抑制素A（INHA）ELISA試劑盒說明書
本試劑僅供研究使用 目的：本試劑盒用于測定大鼠血清，血漿及相關(guān)液體樣本中抑制素A（INHA）的含量。
抑制素A實驗原理：
本試劑盒應用雙抗體夾心法測定標本中大鼠抑制素A（INHA）水平。用純化的大鼠抑制素A（INHA）抗體包被微孔板，制成固相抗體，往包被單抗的微孔中依次加入抑制素A（INHA），再與HRP標記的抑制素A（INHA）抗體結(jié)合，形成抗體-抗原-酶標抗體復合物，經(jīng)過*洗滌后加底物TMB顯色。TMB在HRP酶的催化下轉(zhuǎn)化成藍色，并在酸的作用下轉(zhuǎn)化成zui終的黃色。顏色的深淺和樣品中的抑制素A（INHA）呈正相關(guān)。用酶標儀在450nm波長下測定吸光度（OD值），通過標準曲線計算樣品中大鼠抑制素A（INHA）濃度。
抑制素A試劑盒組成：
試劑盒組成 48孔配置 96孔配置 保存
說明書 1份 1份
封板膜 2片（48） 2片（96）
密封袋 1個 1個
酶標包被板 1×48 1×96 2-8℃保存
標準品：225ng/L 0.5ml×1瓶 0.5ml×1瓶 2-8℃保存
標準品稀釋液 1.5ml×1瓶 1.5ml×1瓶 2-8℃保存
酶標試劑 3 ml×1瓶 6 ml×1瓶 2-8℃保存
樣品稀釋液 3 ml×1瓶 6 ml×1瓶 2-8℃保存
顯色劑A液 3 ml×1瓶 6 ml×1瓶 2-8℃保存
顯色劑B液 3 ml×1瓶 6 ml×1瓶 2-8℃保存
終止液 3ml×1瓶 6ml×1瓶 2-8℃保存
濃縮洗滌液 （20ml×20倍）×1瓶 （20ml×30倍）×1瓶 2-8℃保存
樣本處理及要求：
1. 血清：室溫血液自然凝固10-20分鐘，離心20分鐘左右（2000-3000轉(zhuǎn)/分）。仔細收集上清，保存過程中如出現(xiàn)沉淀，應再次離心。
2. 血漿：應根據(jù)標本的要求選擇EDTA或檸檬酸鈉作為抗凝劑，混合10-20分鐘后，離心20分鐘左右（2000-3000轉(zhuǎn)/分）。仔細收集上清，保存過程中如有沉淀形成，應該再次離心。
3. 尿液：用無菌管收集，離心20分鐘左右（2000-3000轉(zhuǎn)/分）。仔細收集上清，保存過程中如有沉淀形成，應再次離心。胸腹水、腦脊液參照實行。
4. 細胞培養(yǎng)上清：檢測分泌性的成份時，用無菌管收集。離心20分鐘左右（2000-3000轉(zhuǎn)/分）。仔細收集上清。檢測細胞內(nèi)的成份時，用PBS（PH7.2-7.4）稀釋細胞懸液，細胞濃度達到100萬/ml左右。通過反復凍融，以使細胞破壞并放出細胞內(nèi)成份。離心20分鐘左右（2000-3000轉(zhuǎn)/分）。仔細收集上清。保存過程中如有沉淀形成，應再次離心。
5. 組織標本：切割標本后，稱取重量。加入一定量的PBS，PH7.4。用液氮迅速冷凍保存?zhèn)溆?。標本融化后仍然保?-8℃的溫度。加入一定量的PBS（PH7.4），用手工或勻漿器將標本勻漿充分。離心20分鐘左右（2000-3000轉(zhuǎn)/分）。仔細收集上清。分裝后一份待檢測，其余冷凍備用。
6. 標本采集后盡早進行提取，提取按相關(guān)文獻進行，提取后應盡快進行實驗。若不能馬上進行試驗，可將標本放于-20℃保存，但應避免反復凍融.
7. 不能檢測含NaN3的樣品，因NaN3抑制辣根過氧化物酶的（HRP）活性。
操作步驟
1. 標2. 準品的稀釋與加樣：在酶標3. 包被板上設標4. 準品孔10孔，5. 在*、第二孔中分別加標6. 準品100μl，7. 然后在*、第二孔中加標8. 準品稀釋液50μl，9. 混勻；然后從*孔、第二孔中各取100μl分別加到第三孔和第四孔，10. 再在第三、第四孔分別加標11. 準品稀釋液50μl，12. 混勻；然后在第三孔和第四孔中先各取50μl棄掉，13. 再各取50μl分別加到第五、第六孔中，14. 再在第五、第六孔中分別加標15. 準品稀釋液50ul，16. 混勻；混勻后從第五、第六孔中各取50μl分別加到第七、第八孔中，17. 再在第七、第八孔中分別加標18. 準品稀釋液50μl，19. 混勻后從第七、第八孔中分別取50μl加到第九、第十孔中，20. 再在第九第十孔分別加標21. 準品稀釋液50μl，22. 混勻后從第九第十孔中各取50μl棄掉。（稀釋后各孔加樣量都為50μl，23. 濃度分別為150ng/L，24. 100ng/L ，25. 50ng/L，26. 25ng/L，27. 12.5ng/L）。
28. 加樣：分別設空白孔（空白對照孔不29. 加樣品及酶標30. 試劑，31. 其余各步操作相同32. ）、待測樣品孔。在酶標33. 包被板上待測樣品孔中先加樣品稀釋液50μl，34. 然后再加待測樣品10μl（樣品zui終稀釋度為5倍35. ）。加樣將樣品加于酶標36. 板孔底部，37. 盡量不38. 觸及孔壁，39. 輕輕晃動混勻。
40. 溫育：用封板膜封板后置37℃溫育30分鐘。
41. 配液：將30（48T的20倍42. ）倍43. 濃縮洗滌液用蒸餾水30（48T的20倍44. ）倍45. 稀釋后備46. 用。
47. 洗滌：小心揭掉封板膜，48. 棄去液體，49. 甩干，50. 每孔加滿洗滌液，51. 靜置30秒后棄去，52. 如此重復53. 5次，54. 拍干。
55. 加酶：每孔加入酶標56. 試劑50μl，57. 空白孔除外。
58. 溫育：操作同59. 3。
60. 洗滌：操作同61. 5。
62. 顯色：每孔先加入顯色劑A50μl，63. 再加入顯色劑B50μl，64. 輕輕震65. 蕩混勻，66. 37℃避光顯色15分鐘.
67. 終止：每孔加終止液50μl，68. 終止反應（此時藍色立轉(zhuǎn)黃色）。
69. 測定：以空白空調(diào)零，70. 450nm波長依序測量各孔的吸光度（OD值）。 測定應在加終止液后15分鐘以內(nèi)進行。
注意事項：
1． 試劑盒從冷藏環(huán)境中取出應在室溫平衡15-30分鐘后方可使用，2． 酶標3． 包被板開封后如未用完，4． 板條應裝入密封袋中保存。
5． 濃洗滌液可能會有結(jié)晶析出，6． 稀釋時可在水浴中加溫助溶，7． 洗滌時不8． 影響結(jié)果。
9． 各步加樣均應使用加樣器，10． 并經(jīng)常校對其準確性，11． 以避免試驗誤差。一次加樣時間控制在5分鐘內(nèi)，12． 如標13． 本數(shù)量多，14． 推薦使用排槍加樣。
15． 請每次測定的同16． 時做標17． 準曲線，18． 做復19． 孔。如標20． 本中待測物質(zhì)含量過高（樣本OD值大于標21． 準品孔*孔的OD值），22． 請先用樣品稀釋液稀釋一定倍23． 數(shù)（n倍24． ）后再測定，25． 計算時請zui后乘以總稀釋倍26． 數(shù)（×n×5）。
27． 封板膜只限一次性使用，28． 以避免交叉污染。
29． 底物請避光保存。
30． 嚴格按照說明書的操作進行，31． 試驗結(jié)果判定必須以酶標32． 儀讀數(shù)為準.
33． 所有樣品，34． 洗滌液和各種廢棄物都應按傳染物處理。
35． 本試劑不同36． 批號組分不37． 得混用。
計算：
以標準物的濃度為橫坐標，OD值為縱坐標，
在坐標紙上繪出標準曲線，根據(jù)樣品的OD
值由標準曲線查出相應的濃度；再乘以稀釋
倍數(shù)；或用標準物的濃度與OD值計算出標
準曲線的直線回歸方程式，將樣品的OD值
代入方程式，計算出樣品濃度，再乘以稀釋
倍數(shù)，即為樣品的實際濃度。
試劑盒性能：
1.樣品線性回歸與預期濃度相關(guān)系數(shù)R值為0.990以上。
2.批內(nèi)與批見應分別小于9%和11%
保存條件及有效期：
1.試劑盒保存：；2-8℃。
2．有效期：6個月
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